加州大学开发基于冷冻电镜技术的结构蛋白组研究方法 助力科研

   物极必反        

2019年11月25日,加州大学洛杉矶分校(UCLA)周正洪组在Nature Methods在线发表题为Bottom-up structural proteomics: cryoEM of protein complexes enriched from the cellular milieu文章,提出一种自下而上的高通量结构蛋白组研究方法。利用该方法,研究人员可直接从细胞匀浆富集多种内源性蛋白,并利用冷冻电镜单颗粒分析技术获得多个近原子分辨率(未知)电镜结构。作者开发的cryoID程序可准确、高效地从数万条候选序列中鉴别出未知电镜结构的蛋白序列,并辅助原子模型搭建工作。作为例证作者将该方法应用于引起疟疾的恶性疟原虫,获得了多个重要蛋白复合物的近原子分辨率结构。该方法为具有挑战性的蛋白复合物结构研究提供了新思路。


加州大学开发基于冷冻电镜技术的结构蛋白组研究方法 助力科研

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周正洪组提出从未知电镜结构中选取高分辨率区域进行序列搭建(以下称检索序列),然后利用序列搜索比对方法从候选序列库(可由蛋白样品质谱分析获得)中鉴别出目标蛋白序列。由于部分氨基酸侧链形状非常相似,仅仅根据电镜结构侧链密度图进行准确的氨基酸预测与检索序列搭建非常困难(例如天冬氨酸D和天冬酰胺N很难被区分开)。为应对这个挑战,周正洪组根据二十种氨基酸侧链形状相似性将它们简化为六个类,并使用简化类进行检索序列搭建与搜索。例如,天冬氨酸D和天冬酰胺N被归为亮氨酸类(用L表示),在检索序列搭建过程中将它们预测为亮氨酸类即可。简化类的使用引入了容错机制,大大提高了检索序列的准确率。周正洪组开发的cryoID程序可自动定位未知冷冻电镜结构中信号好的区域并搭建检索序列原子模型供用户查看,之后cryoID调用经优化的BLASTP程序对简化的检索序列和候选序列进行序列搜索比对,找到匹配的蛋白序列。利用模拟数据和已发表电镜结构的测试结果表明,cryoID可从上万条候选序列(蛋白组或由质谱分析获得的候选序列库)中准确、高效鉴别出目标蛋白序列。


加州大学开发基于冷冻电镜技术的结构蛋白组研究方法 助力科研


恶性疟原虫可引起疟疾。使用传统方法进行恶性疟原虫蛋白结构解析遭遇了极大挑战。周正洪组将他们的结构蛋白组研究方法应用于恶性疟原虫,从同一样品中获得了三种蛋白的四个近原子分辨率结构,经cryoID鉴别是M18 aspartyl aminopeptidase,glutamine synthetase和20S proteasome两个不同构象结构。


加州大学开发基于冷冻电镜技术的结构蛋白组研究方法 助力科研


论文的共同第一作者是UCLA的Chi-Min Ho博士和中国科大的李晓润博士,通讯作者是UCLA的周正洪教授。有多位来自不同学科的研究人员参与此项目。


背景


自DNA重组技术和蛋白亲和纯化方法问世以来,研究人员利用蛋白异源表达纯化技术与X射线晶体衍射学方法解析了大量蛋白的高分辨结构,极大地丰富了我们对细胞中各种重要生命过程分子机制的认知。然而这种方法需要大量高纯度蛋白样品,无法应用于异源系统表达量较低或或不易结晶的蛋白样品,比如大的蛋白复合物。另外,由于蛋白异源表达过程涉及蛋白序列的剪切、突变及添加标签,这种方法获得的重组蛋白结构可能无法准确反映细胞中内源蛋白的分子作用机理。


近年来冷冻电镜技术发展迅猛。与传统方法相比,冷冻电镜单颗粒分析技术对蛋白样品的数量和纯度要求大大降低,且可获得蛋白不同构象结构。周正洪组进一步发现冷冻电镜单颗粒技术可用于研究从细胞匀浆直接富集的内源蛋白样品,从同一样品中获得多个内源蛋白的近原子分辨率电镜结构。这种高通量的自下而上的结构蛋白组研究方法样品制备流程简单,可捕捉到蛋白在细胞内行使功能时的结构,但也产生了非常有趣且富有挑战性的问题:这些近原子分辨率电镜结构是什么?该如何搭建原子模型?


文章来源: BioArt

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