搭载新型微芯片的电子显微镜,可快速对血小板进行原位成像!

   电子分析员        

生物标本或纳米颗粒的超微结构观察通常需要使用电子显微镜。电子显微术耗时长,需要许多步骤,使用许多化学物质,这可能会影响生物标本的原生状态。采用一种新型微晶片(K-kit)作为人血小板颗粒水溶液中透射电镜原位成像的标本试剂盒。这种微芯片使研究人员能够非常快速、容易地观察人类天然血小板颗粒。方法包括血液采集、血小板纯化、血小板颗粒分离、样品装入芯片,透射电镜观察。此外,这些颗粒仍可在水溶液中保留,只需要非常少量的样品进行观察和分析。研究人员用这种微芯片通过阴性染色来鉴定天然血小板颗粒。此外,研究人员利用该微晶片进行免疫电镜观察,成功地用抗p选择素抗体标记α-颗粒血小板。这些结果表明,当使用透射电子显微镜在水条件下检查生物标本的纳米颗粒时,这种新型微芯片可以为研究人员提供更快、更好的选择。


相关论文以题为“A Novel Microchip Technique for Quickly Identifying Nanogranules in an Aqueous Solution by Transmission Electron Microscopy: Imaging of Platelet Granules”发表在《Applied Sciences》上。


搭载新型微芯片的电子显微镜,可快速对血小板进行原位成像!


生物标本的超微结构通常用透射电子显微镜(TEM)来观察。为了获得高分辨率的超微结构图像,传统透射电镜需要多个复杂的步骤,包括样品固定、脱水、浸润、包埋、超薄切片和染色。如果其中一个步骤做得不好,超微结构图像可能会显示许多伪影。因此,用传统的透射电镜观察生物样品的超微结构需要花费大量的时间和高水平的技术。此外,由于大多数生物标本柔软且富含水分,在进行超薄切片之前,样品需要固定、脱水、浸润并嵌入许多化学物质。这些化学物质可能会影响原始的超微结构。因此,很多形态学家都在积极寻找更快、更有效的材料和方法来观察纳米尺度的生物样品,而不影响其超微结构。


血小板的功能分析需要分离和纯化膜结合颗粒和细胞腔室。蔗糖密度梯度分离法或免疫磁分选法纯化和测定分离血小板颗粒类型的方案需要1-2天完成。在本研究中,研究人员使用最新开发的微芯片(K-kit),通过阴性染色在水溶液中快速观察和鉴定分离血小板颗粒的类型。此外,研究人员还利用微晶片进行免疫电镜观察,用抗p选择素抗体对α-颗粒进行鉴别和确认。本研究结果为快速观察纳米级生物标本的超微结构提供了一种先进的方法和技术。


K-Kit微芯片的结构和指令


该微芯片的结构主要由硅组成。该微芯片的形状为长轴1.7毫米的八角形长方体块,短轴1.4毫米,高度0.8毫米;原理图如图1A所示。样品室是一条狭长的平坦通道,位于微芯片的中间。样品室壁由SiO2膜组成。芯片样品腔中心有一个中空的观察窗口(300μm×25μm×2μm)。电子束可以通过观察窗,然后通过样品。如果一个样品是电子密度的,电子束将被阻挡或移动,因此显示一个较暗的图像。由于样品室是一个狭窄的通道,可以通过毛细吸力将样品装入样品室。通过两端试样室的开口接触水溶液,试样被吸入试样室(如图1A中的椭圆圈所示)。标本后进入样品室,样品室的两端密封托密封设备(包含环氧树脂和固化剂),然后整个芯片放在坚持一个铜网格(3毫米的外径和内径1毫米)。将带有微晶片的铜栅置于样品架中,在电子显微镜下进行检查(图1B)。


搭载新型微芯片的电子显微镜,可快速对血小板进行原位成像!


图1.K-kit微芯片的示意图。(A) K-kit微芯片的三维结构由金属硅组成,呈八角形立方体状块体(1.7毫米×1.4毫米×0.8毫米)。在微晶片长轴的左右两端有两个小样品室开口。液体标本可以通过开口(如图卵形圆所示)接触标本自然进入样品室。将微芯片的上下两侧压下,形成观察窗口。只有观察窗口的区域允许电子显微镜的电子束穿过标本,产生标本的高分辨率图像。(B)将K-kit微晶片装入液体标本后,密封样品腔的两端,将微晶片放置并固定在一个铜栅的中心(直径为3毫米,中间有一个直径为1毫米的孔)。与微芯片相结合的栅格可直接放置在传统电子显微镜的栅格支架上进行超微结构检查。


传统透射电镜下血小板、颗粒图像


孤立静息血小板呈圆形或卵圆形双盘状,长轴平均直径2-3μm。在传统的电镜检查中,研究人员可以在细胞质中发现线粒体、液泡和几个膜包围的颗粒(图2A)。膜包膜颗粒主要有两种类型。α-颗粒丰富,染色均匀,颜色浅,直径约200 ~ 300nm。致密颗粒呈暗色,小于α颗粒。由于致密颗粒较少,切片时不容易看到。血小板也含有圆形或伸长的膜包围的小泡或液泡,它们代表开放小管系统(OCS)的部分,OCS的开口位于血小板表面(图2A)。


在激活的初始阶段,血小板表现出伪足的形成和颗粒成分的释放(图2B)。颗粒将其内容物直接释放到表面或进入OCS。研究人员观察到颗粒内容物正从活化的血小板表面释放出来(图2B中的星号)。此外,活化血小板的α-颗粒通常从膜上分离出一个相对中心的电子致密核(图2B中的箭头)。致密颗粒比α-颗粒小,核心高密度,周围有无斑点的边缘(如图2B)。


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图2.静止和活跃的人类血小板的电子显微图。(A)一个休息的血小板是椭圆形(长轴长度约2µm),和充满许多膜结合颗粒。这些颗粒大部分为直径约200 nm的α-颗粒,含有灰色均质物质。此外,研究人员还可以在细胞质中发现线粒体和小泡。但在该图中未观察到致密的颗粒。弯曲箭头表示在静息血小板表面膜上有一个开放的小管系统(OCS)。(B)活性血小板显示伪足扩大。活化后,活性血小板中的α-颗粒有一个密度更高的电子核(用箭头表示)。弧形箭头还表示活性血小板表膜上有OCS开放。此外,研究人员观察到颗粒与膜接触,从膜中释放出颗粒物质,有液体物质渗出(星号表示)。图下方的另一个血小板中可见一个高密度的颗粒,其核心被一个无斑点的边缘包围(箭头所示)。α,α颗粒;D,密集的颗粒;米,线粒体;比例尺0.2μm。


K-kit微芯片血小板颗粒染色阴性


研究人员将水溶液中分离的血小板颗粒与醋酸铀酰混合进行阴性染色,然后在电子显微镜下用K-kit微芯片直接检测。显微照片显示在微晶片的腔室中有几种类型的颗粒(图3A)。膜结合颗粒呈圆形或卵圆形,其长轴平均直径约为200 nm,短轴平均直径约为100 nm(图3B)。其他小颗粒或小泡可能是溶酶体、液泡或OCS的碎片。但由于致密颗粒数量较少,在阴性染色样品中,研究人员没有发现并鉴定带有膜结合颗粒的电子致密核。


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图3.微芯片中分离血小板颗粒的电镜阴性染色。(A)显微图像中有多种不同大小的分离血小板颗粒。阴性染色后分离血小板颗粒边界呈黑色。其中α-颗粒大而圆或椭圆形,灰质含量均匀(以白色箭头表示)。一个高密度的颗粒被无斑点的边缘包围(用白色箭头表示)。电子密度低、颜色呈灰白色的圆形小泡称为溶酶体或外泌体。还观察到一些破碎颗粒。(B)高倍镜示染色阴性颗粒。α-颗粒(白色箭头所示)的长轴长度约为200 nm。比例尺0.2μm。


利用K-Kit微芯片对α-颗粒进行免疫金标记鉴定


研究人员使用K-kit芯片进行免疫电镜观察,用抗p选择素抗体对血小板α-颗粒进行鉴定。在K-kit芯片的腔室中有几种不同大小的颗粒。颗粒的边界不是很清晰,因为研究人员没有进行负染色以避免掩盖金颗粒的标签。使用抗p -选择素抗体的免疫金标记技术显示,颗粒表面有一层厚厚的金颗粒装饰(图4A)。几个没有大量金颗粒标记的小泡可能是溶酶体或外泌体。颗粒的平均直径约为200 nm,表面有丰富的金颗粒装饰,应为α-颗粒(图4B)。这些结果表明,研究人员可以成功地使用K-kit芯片进行免疫金标记技术来识别特定的纳米颗粒。


搭载新型微芯片的电子显微镜,可快速对血小板进行原位成像!


图4.微晶片中分离血小板颗粒的免疫电子显微图。(A)这张照片显示,6nm金粒子标记的颗粒为α-颗粒,因为p选择素位于这些颗粒的表面。其他未被金颗粒明显标记的小泡可能是溶酶体或外泌体。(B)高倍放大显示标记过的金颗粒。α-颗粒表面(箭头所示)有丰富的金颗粒。比例尺0.2μm。


结论


在这项研究中,研究人员使用一种新型的K-kit微芯片成功地观察了水溶液中人类血小板的天然纳米颗粒。与传统的TEM、SEM、Cryo-EM和流式细胞术技术相比,该芯片更简单,更容易操作。此外,这种新型微晶片还可以应用于免疫电子显微镜,对分离的血小板α颗粒进行成功的标记和鉴定。研究人员相信,这些材料和技术将在生物医学领域有进一步的发展和应用前景。


论文链接:https://www.mdpi.com/2076-3417/10/14/4946/htm



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