新型荧光显微镜,可对单个癌细胞进行纵向跟踪!

   电子分析员        

来源于肿瘤的细胞系是表型上不同细胞的异质混合物。这些癌细胞系被广泛用于寻找新的抗癌药物和研究其作用机制。今天的大多数研究都是基于人群的,这意味着小的细胞亚群对潜在药物的不同反应没有被发现。这是一个特别与肿瘤中最具侵袭性的单个癌细胞有关的问题,因为它们似乎对目前使用的药物不敏感。当开发新的抗癌药物时,这些细胞在基于人群的研究中没有被检测到。因此,要更深入地了解所有单个癌细胞对化疗药物的反应,就需要对单个细胞进行纵向跟踪。在这里,研究人员使用数字全息技术对JIMT-1乳腺癌细胞进行了长时间的成像和纵向跟踪。为了进一步了解追踪细胞,研究人员将数字全息术与荧光显微镜相结合。研究人员根据CD24和E-cadherin的表达将JIMT-1细胞分组到不同的亚群中,分析72小时的细胞增殖和细胞迁移。研究人员研究了肿瘤干细胞(CSC)靶向药物salinomycin对不同亚群的影响。


相关论文以题为“Salinomycin Treatment Specifically Inhibits Cell Proliferation of Cancer Stem Cells Revealed by Longitudinal Single Cell Tracking in Combination with Fluorescence Microscopy”发表在《Applied Sciences》上。


新型荧光显微镜,可对单个癌细胞进行纵向跟踪!


近十年来,肿瘤干细胞(CSCs)在癌症发生和复发中的重要性在癌症研究中得到了越来越多的关注。肿瘤包含了表型上不一致的癌细胞的混合物。一个肿瘤中只有少数细胞属于CSC群体,但对于许多不同来源的肿瘤来说,似乎主要是CSCs能够产生与原肿瘤表型组成相似的新肿瘤。由于CSCs耐药且有利于肿瘤转移,因此越来越需要新的药物和治疗策略来减少CSCs。在乳腺癌中,细胞表面标记物CD44的高表达和细胞表面标记物CD24的低表达被用来鉴定CSCs。


在一项旨在寻找针对乳腺癌中这个亚群的药物的高通量筛选研究中,发现阳离子离子团盐霉素可靶向CSCs。随后,salinomycin被发现在许多人类癌症类型中靶向CSCs,包括白血病、胃癌、结直肠癌、骨肉瘤、胰腺癌、前列腺癌、头颈部鳞状细胞癌、肺癌。许多不同的机制归因于盐霉素的行动,如肌动蛋白的破坏应力纤维,downregulation具备干细胞相关的信使rna和蛋白质,线粒体功能受损,诱导自噬,ATP含量下降和增加活性氧的生产,封存的铁溶酶体和诱导的活性氧物种,与细胞生存能力下降,这样的结果增殖,迁移,以及刺激间质向上皮转变。Salinomycin也被证明可以增加E-cadherin的表达,E-cadherin是上皮细胞表面发现的一种钙依赖性细胞黏附糖蛋白分子。E-cadherin表达水平与不同细胞系的致瘤性呈负相关,其中E-cadherin高表达与低致瘤性相关,低表达与低致瘤性相关。然而,在临床结果中,E-cadherin在中的作用和相关性尚不清楚,且已发现其表达水平在不同分类的肿瘤中存在差异。


本研究的目的是对使用数字全息显微镜和荧光显微镜联合获得的细胞图像进行纵向跟踪,以识别跟踪细胞上CD24和E-cadherin的表达。本研究旨在研究JIMT-1细胞亚群之间细胞周期长度和迁移行为的差异,以及salinomycin对这些参数在不同亚群中的影响。研究人员使用JIMT-1乳腺癌细胞系研究不同化合物(包括salinomycin和salinomycin类似物)对CSCs的影响,并使用数字全息显微镜进行研究。该细胞系含有大量对不同处理敏感的CSCs。在这里,研究人员加深了对salinomycin治疗如何减少JIMT-1细胞的CSC亚群的动态洞察。总之,这些数据表明,JIMT-1细胞亚群之间的主要差异与细胞增殖有关,而salinomycin处理的最初效果是降低CD24−细胞的增殖。


结合荧光和跟踪的数字全息延时成像


对于数字全息显微镜(DHM), HoloMonitor®M4(相位全息成像AB (PHI),瑞典隆德)用于延时成像。使用软件Hstudio™(PHI)获取图像。为了提高图像质量,在开始成像之前,将培养皿的标准盖子替换为HoloLid™71 110 (PHI)。


该成像使用了两种不同的时间设置。首先,使用图1A上半部分所示的24小时时间间隔来评估数字全息显微镜与荧光相结合的方法。细胞被播种在培养皿中,其中一些被用于成像方法24 - 48 h后播种(例如,延时/治疗时间0-24 h)和一些延时成像播种后48 - 72 h(即延时/治疗时间24 - 48小时)。因此,一个48小时时间间隔分为两个连续24小时延时,平行样本成像的不同的时间间隔。对于另一种设置,不间断对样品进行48小时成像,即从播种后24-72小时开始(即0-48小时的延时/处理时间),如图1A下方所示。


新型荧光显微镜,可对单个癌细胞进行纵向跟踪!


图1.实验装置的示意图。(A)播种前,在培养皿底部外侧标记一个区域。在时间-24小时,细胞被接种到多个培养皿中。(Applsci 1004732i001)。撒种24小时后,将Salinomycin加入终浓度0.5 interm (Applsci 10 04732 i002)。标记区域内的细胞被数字全息成像24小时和48小时时间(Applsci 04732 i003,延时3)的启动延时后立即治疗(Applsci 04732 i004,延时1)或治疗后24小时(Applsci 10 04732 i005,延时2)。延时后,细胞用fitc标记的抗cd44抗体和pe标记的抗cd24抗体固定并标记,或用Alexa Flour 488标记的抗e -cadherin抗体和pe标记的抗cd24抗体标记并在荧光显微镜下成像。(B)通过数字全息图像延时跟踪细胞的代表性图像。彩色的轨迹显示细胞在延时期间的运动。跟踪是所有纵向分析的基础。(C)用于视觉叠加的代表性图像,以便在延时中进行细胞识别。左图:数字全息术。右上方图像:荧光,CD44染色。右下角图像:荧光,CD24染色。红框对应于数字全息成像的区域图像。


使用如图1A所示的拼接模式在标记的正方形内捕获时移图像。每个广场采集16张图像,覆盖整个区域。每15分钟采集一次图像。因此,对于每个正方形,每15分钟采集一次图像采集16次时间间隔。实验重复3次,每个菜盘分析两次时间间隔,即每个图包含6次每次处理和时间间隔。


在时间间隔结束时,将细胞固定在4%甲醛中,并按照如下方法进行标记,以便根据CD24、CD44和E-cadherin的表达进行鉴定。


荧光定量


对于CD24- pe荧光,细胞被直观地量化为完全无荧光(CD24)或荧光(CD24+)。上皮表达,细胞被直观地量化为低钙粘蛋白(E-cadlow)表面弱表达,钙粘蛋白(E-cadmid)中期走强表达表面但弱边缘,或钙粘蛋白高(E-cadhigh)与一个强大的表达在细胞边缘以及表达整个表面。E-cadherin的表达为红(低)、蓝(中)、绿(高);图2)。


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图2.纵向跟踪结合荧光成像的JIMT-1细胞培养存在或不存在0.5的M salinomycin。(A)基于图S2中的原始数据,纵向跟踪数字全息显微镜(DHM)时程,显示为代表性的细胞系谱树。每个图板中的虚线分隔了CD24+和CD24−细胞群以及未知细胞(UN,无标签)。E-cadherin的表达以0 - 48h面板末端圆的颜色表示,红色=低,蓝色=中,绿色=高。O:已知荧光表达,X:因延时结束前分裂、细胞聚集或延时结束前离开画面而产生的未知表达。(B1-4)根据48小时荧光表达情况,将JIMT-1细胞分成不同的组。


最大运动速度是每个细胞在处理时间内的累积距离(最大运动速度)除以跟踪时间(图3A,B)。图3A,B显示,在对照组和盐菌素处理的培养基中,荧光表达未知的细胞的最大运动速度没有差异。图3A,B也显示了最大运动速度的变化取决于CD24和E-cadherin在对照组和盐菌素处理的培养基中的表达。但是,盐霉素处理的培养基(图3B)比对照组(图3A)的变化更大,盐霉素处理的最大运动速度最高。仅通过E-cadherin表达比较对照组和盐霉素处理的细胞的最大运动速度时,盐霉素处理显著提高了三个E-cadherin组的最大运动速度(低:p <0.0001,中:p<0.01;高:p <0.0001)。仅通过CD24的表达比较对照组和盐菌素处理的细胞的最大运动速度,CD24+细胞之间没有显著差异,但CD24 -细胞盐菌素处理的最大运动速度明显高于对照组(p <0.0001)。简而言之,不依赖于E-cadherin的表达,salinomycin处理导致CD24 -表达的细胞移动更快。


新型荧光显微镜,可对单个癌细胞进行纵向跟踪!


图3.在无或存在0.5 M salinomycin条件下培养JIMT-1细胞的运动行为。治疗后立即开始使用延时数字全息成像对细胞进行48小时的成像。延时成像后,固定细胞,染色观察CD24和E-cadherin的表达,并在与延时成像相同视场获得荧光图像。延时跟踪的细胞被鉴定为CD24+或CD24, E-cadherin表达被鉴定为低、中、高,分为6组。被跟踪但在DHM延时的最后一帧中没有出现的细胞称为unknown (UN)。最大运动速度(A,B)是治疗时间上的累计距离(最大运动速度)除以跟踪时间。平均偏移直接性(C,D)是偏移量,即跟踪起始点到终点的最短距离,除以运动性。(A) CD24+细胞和CD24−细胞(p = 0.0008)以及E-cadherin低表达或高表达细胞(p = 0.007)的最大运动速度存在显著差异。CD24+E-cadmid细胞与CD24−E-cadmid细胞之间也存在显著差异(p = 0.002)。(B) E-cadherin低表达和中表达细胞之间的最大运动速度存在显著差异(p<0.0001)和高表达(p <0.0001)。CD24 - E-cadlow细胞与CD24 - E-cadmid细胞之间也存在显著差异(p<0.0001)。(C)平均迁移直接性方面,E-cadherin低表达细胞与中表达细胞比较差异有统计学意义(p值= 0.008),CD24+E-cadlow细胞与CD24+E-cadlow细胞比较差异有统计学意义(p = 0.004)。(D)不同组的盐菌素处理细胞的平均迁移直接性没有显著差异。(A,B) Salinomycin治疗显著提高了E-cadherin三组的最大运动速度(低:p <0.0001,中:p <0.01;p <0.0001)与对照组比较。(C,D) Salinomycin处理明显降低了E-cadherin低表达细胞的平均迁移直接性(e -钙粘蛋白中表达(p <0.001)。所有的统计数据用单因素方差分析进行评估,Tukey honest有显著差异。


研究人员目前关于细胞如何对不同种类的扰动作出反应的大部分知识是基于对整个细胞种群反应的分析。单个细胞可以被分析,例如,通过使用流式细胞术作为末端反应测定,它可能显示研究实体的异质性。然而,生物学上的一个挑战是理解每个个体细胞过程中的动力学,它导致最终反应的异质性。显微技术,如共聚焦显微镜,免疫荧光显微镜,相位对比显微镜,和DHM今天被用于通过延时成像跟踪单个活细胞的行为。所有的方法都有其优点和缺点。这里研究人员使用DHM是因为它具有低光毒性的优点,而且它是无标签的。无标签显微镜的缺点是细胞识别存在问题。在这里,研究人员通过分析结合DHM和荧光显微镜鉴定出的JIMT-1乳腺癌细胞的不同亚群来解决这些问题。


结论


总之,DHM和荧光显微镜的结合是强大的。研究人员首次表明,在salinomycin处理24小时后,CD24 - CSC亚群的减少是由于CD24 -群体的增殖受到了特异性抑制,而CD24+群体没有受到影响。这表明,salinomycin处理引起的表型向少干性的转变是由于CD24+细胞的阳性选择。


论文链接:https://www.mdpi.com/2076-3417/10/14/4732/htm



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