基于PDMS的微型设备,可用于捕获MicroRNA生物标志物!

   电子分析员        

循环生物标志物的分离和分析是液体活检的主要考虑因素,可以大大受益于微流体。微流体确实有巨大的潜力,使液体活检进入临床实践。在这里,两种基于聚二甲基硅氧烷(PDMS)的微型设备被作为有效工具从临床相关样本中捕获microRNAs生物标志物。通过对功能化聚二甲基硅氧烷(PDMS)吸附/洗脱microRNAs性能的广泛研究,将最佳条件转移到微器件上,并对其进行了彻底的表征。测量了通道的形貌和化学成分,并为测量的自动化设置了参数。然后将最佳工作条件用于微设备,这些设备已被证明可以在所有通道表面捕获microRNAs。最后,通过实时PCR成功验证了微流控设备,检测了一组与非小细胞肺癌相关的microRNAs,并选择其作为原理验证。本文所述的微流控方法将使高效微设备的实现向前迈进一步,可能实现自动化并集成到具有高分析潜力的微流控芯片实验室中。


相关论文以题为“PDMS-Based Microdevices for the Capture of MicroRNA Biomarkers”发表在《Applied Sciences》上。


基于PDMS的微型设备,可用于捕获MicroRNA生物标志物!


近年来,能够在病理学的早期阶段检测出最少量的生物标志物的非侵入性但特定的诊断分析的概念已经得到了极大的发展。实际上,为个体患者量身定制医疗服务的能力与从少量的生物学样本开始在整个时间内收集有关该个体的信息的可能性有关。为了对此,液体活检获得显著关注的生物标志物分析和发现,特别是癌症。在这种情况下,微流体技术具有巨大的潜力,可改变临床环境中采样,样品分离,混合,化学反应和生物标志物检测方法。


在适用于微系统制造的不同材料中,聚二甲基硅氧烷(PDMS)已被广泛用于各种微流体应用中,包括用于制造芯片实验室和微型整体分析系统。PDMS,一种基于有机硅的有机弹性体,确实是一种低成本,柔性,光学透明且易于加工的材料。这种聚合物被广泛用于微流体和灵活的亲和力传感平台由于具有许多优点,例如旨在减少样品和试剂数量的小型化,最小化时间和成本,提高可重复性,自动进行分离和检测。已经提出了基于PDMS的不同微流体平台,以提供用于分析物的纯化,处理和感测的微通道或微腔,以实现高分辨率和高灵敏度的分离和检测。此外,PDMS被识别为高度生物相容的材料,其具有自发和强烈吸附核酸。当PDMS表面带有正电荷时,这种效果会更加明显,由于该材料具有用硅烷基团官能化的能力,因此容易进行改性。不仅容易获得PDMS的功能,而且PDMS本身也可用于在其他聚合物材料上引入新的特性。


研究人员已经展示了基于PDMS-微型巨大潜力的净化和生物标记的分析。在此,他们介绍了螺旋形微器件的两种配置。两种配置具有不同的几何形状,它们显示出不同的表面体积(S / V)比。这方面特别重要,因为具有较高S / V的微流控设备可以吸附更多数量的生物标记,并可能捕获更多数量的稀有microRNA。microRNA的捕获发生在微设备表面,其表面上带有正电荷,能够吸引存在于microRNA主链磷酸基团上的负电荷。在对PDMS在吸附/洗脱microRNA中的性能进行了广泛研究后,将最佳条件转移到两种类型的微流控设备中,并对它们进行了深入表征。


PDMS微设备制造


两种类型的微流体装置的制造如下:通过模铸获得上部PDMS反应室,然后将其粘结在被PDMS薄层覆盖的硅载体上。反应室被设计(图1,小图的(a)和(b))由3D计算机辅助设计(CAD)软件(犀牛®)和模制在一个螺旋形的模板上的硅晶片载体与SU-8光刻制造(图1,面板(c))。详细地,第一螺旋装置(从现在开始称为芯片A)被设计成具有方形通道,其截面为200μm宽和200μm深,壁间距宽度为200μm。第二个器件(现在称为芯片B)由一个宽60μm,深200μm,壁间距为150μm的矩形横截面定义。两种微流体装置的螺旋通道总长度不同,A芯片为353毫米,B芯片为1078毫米。螺旋通道通过两个入口/出口孔与外部连接。


基于PDMS的微型设备,可用于捕获MicroRNA生物标志物!


图1. 本研究中使用的两种微型设备(面板(a)中的芯片A和面板(b)中的芯片B )中的通道的计算机辅助设计(CAD)表示。面板(c):在单个微器件中切割之前的晶片。面板(d):实验工作流程。将该微型设备放置在适当的支架中,其入口管由微注射器泵供入,出口管收集cDNA用于RT-PCR分析。


如下所述,PDMS微流体装置的制造始于SU-8模具的制备。首先,通过使用旋涂机(Spinner 150 WAFER SPINNER)通过SU-8(Microchemicals GmbH)通过以500 rpm设置10 s和以2000 rpm设置60 s来涂覆硅晶片载体。然后在两个加热步骤中执行软烘烤过程:第一步在65°C下加热8分钟,第二步在95°C下加热80分钟,均在热板上进行。通过在接触模式下使用双面掩模对准器(Neutronix Quintel NXQ 4006),将SU-8暴露于标准UV光刻30秒钟,以确保SU-8与所需掩模图案之间的正确对准。后烘烤的特征还在于两个加热步骤:第一个加热步骤是在热板上于65°C加热5分钟,第二个在95°C加热25分钟。之后,SU-8使用丙二醇甲醚乙酸酯(PGMEA)研制20 s,以获得成品模具。最后,将释放的SU-8结构在170°C下硬烘烤15分钟。为了确保PDMS从模具中正确分离,请使用三氯甲基硅烷(CH3氯3以1:10的比例Si)和甲苯上模具表面进行。在硅烷化之前,对SU-8模具进行O 2等离子体处理(300 W,O 2 30%,1分钟)。接下来,将模具表面通过湿相硅烷化4小时,然后用2-丙醇冲洗,并在170℃的热板上脱水10分钟。


为了进行反应室的铸模,通过以10:1的比例手动混合预聚物和固化剂来制备PDMS,随后进行脱气步骤,然后将PDMS倒在模具上。在120℃下进行固化反应15分钟。将新鲜固化的螺旋室用丙酮和2-丙醇清洗,并在加热板上于70°C下脱水5分钟。同时,将用作支撑体的硅片预先切割,用硫酸和过氧化氢溶液(3:1 v / v比率)清洗5分钟,在水中漂洗3次并用氮气干燥。用旋涂机(Spinner 150 WAFER SPINNER)按照以下步骤在硅载体上涂一层PDMS薄层:500 rpm下5 s,3000 rpm下60 s,并在120°C的热板上固化5分钟。2等离子处理(300 W,O 2 60%,2分钟)。组装完成后,将微流控设备在90°C的烤箱中放置一个小时。图1显示了PDMS微型设备和实验工作流程的方案。


PDMS表面吸附microRNAs的最佳条件


选择PDMS平面模拟微器件通道表面,研究微rna捕获和释放的最佳pH条件。初胺涂层表面和核酸之间的相互作用确实被很好地记录。由于这种现象的主要驱动力是静电相互作用,因此核酸溶液pH值的变化会影响其吸附。作为建立最佳工作条件的第一步,研究了微rna吸附对pH的依赖。此外,考虑到这种用于生物标志物检测的微设备的潜在用途,研究人员选择了合成的miR-1246,因为它可能作为多种癌症类型的生物标志物,包括非小细胞肺癌(NSCLC)。


将合成的miR-1246与荧光染料TAMRA结合,在pH为4 ~ 9的缓冲液中稀释,同时离子强度保持在20 mM,以最大限度减少反离子或离子桥可能的干扰。荧光microRNA在硅烷化的PDMS表面孵育。吸附、洗涤后,用荧光显微镜对表面进行成像。在pH值5左右时,microRNAs的吸附较高,但在中性pH下也观察到相当好的吸附(图2,Panel (a)),这证实了研究人员之前关于氨基硅烷化表面行为的发现。有趣的是,将microRNA在水中(即离子强度极低,pH偏酸性)稀释后,得到了最高的吸附(荧光信号= 26.4×103±180)。考虑到相互作用分子的净电荷,这种行为很容易解释。事实上,RNA分子在生理条件下是带负电荷的,这是由于核酸主干上存在带电荷的磷酸盐基团。在相同的条件下,大多数氨基都是质子化的,如下所述,所以APTMS暴露出一个正极,易于吸引负极分子。相反,在碱性pH条件下,氨基大部分处于未质子化状态,因此APTMS表面呈中性。此外,PEG-s分子的存在有助于正电荷的均匀分布,研究小组证明了这一点。


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图2.MicroRNA吸附(面板(a))和洗脱(面板(b))从平聚二甲基硅氧烷(PDMS)作为博士的函数面板表面(a): 10 ng合成mir - 1246、共轭荧光染料TAMRA,孵化在使硅烷化表面在不同博士三洗后用同样的缓冲孵化,吸附MicroRNA的荧光测量(FA)。图(b):洗脱microRNA (FE)的荧光。用三种不同pH值的缓冲液将吸附在不同pH值下的microRNA从表面洗脱:pH = 5(白色方)、pH = 7(灰色方)和pH = 9(黑色方)。洗脱后,对表面进行成像,并从FA中减去产生的信号,得到洗脱microRNA (FE)的值。数据是至少三个独立重复的均值,而误差条代表标准误差。


从PDMS平面到螺旋形微器件


前几段详细介绍了PDMS平面上功能分析的建立以及螺旋形微器件的表征。然而,这些结果不能直接用于微器件的有效功能化,因此研究人员进行了进一步的实验。具体地说,协议必须适应于自动微设备操作。首先,为了在microRNAs吸附方面提供最好的性能,研究人员安排了硅烷化方案。


将硅烷化混合物AS注入微器件中,然后将微器件在60℃的水中浸泡不同时间。将微设备功能化的时间从几分钟到一小时不等(图3,面板(A)),而所有其他功能化条件保持不变。即使在硅烷化时间较短的情况下,也可以观察到对microRNA的良好吸附,因此可以选择5 min的硅烷化作为后续实验的标准条件。通过在分光光度计上测量从每个微装置收集的未结合的microRNA,这一结论得到了加强。此外,在这种情况下,来自硅烷化5分钟的未结合材料的数量与硅烷化40分钟甚至60分钟的微器件相当。


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图3.从PDMS平面到螺旋微器件的协议优化。荧光mirna用于评估功能化参数。面板(a):硅烷化时间的优化。将0.1% APTMS和0.9% PEG-s硅烷(命名为AS)混合在60℃不同时间的浸泡中使微器件功能化。然后,在水中稀释600 ng的荧光microRNAs被吸收到微器件表面,所产生的荧光被报道为硅烷化时间的函数。面板(b):优化microRNA插入时的通量速度。3 ng/门罗氏miR-1246- tamra以2门罗氏L/min x 100分钟或10门罗氏L/min x 20分钟插入。图(c,d): miR吸附后的洗涤速度优化。共600 ng的miR-1246-TAMRA,在加入裂解缓冲液的人血浆中稀释,孵育在微设备A (c))或B (d)上;然后在不同的熔剂下用水清洗。相对体积被报告。


吸附microRNA的微器件的功能分析


一旦确定了两种微器件的工作参数,就进行了旨在验证两种微器件类型潜力的功能试验。在前面的段落中,所有的参数都是通过宽视野荧光显微镜测量miR-1246-TAMRA存在相关的荧光信号来设定的。这种方法非常适合于对应用于微器件的不同条件进行相对比较,但当需要进行严格的定量分析时,结果却很差。特别是采集到的荧光信号主要与吸附在通道上下表面的microRNA有关,来自通道侧表面的贡献较小。为了检查miRNA在表面吸附的均匀性,使用共聚焦显微镜采集两种微器件通道的三维图像。吸附microRNA后,将两个微器件的通道斜切约30度角,以方便共焦显微镜下的成像(图4)。


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图4.检查表面吸附microRNA的有效性。面板(一):1200 ng mir - 1246 tamra稀释的水吸附在功能化微型装置面板(b): 600 ng mir - 1246 tamra稀释水吸附在功能化微型装置b .洗后,干燥通道斜剪了大约30°的角度,描绘的图像(CAD)表示,和共焦显微镜的成像z-stacking模式。图像是微设备通道的三维重建。


结论


本文介绍了两种螺旋形微器件的制备、表征和功能应用。PDMS微器件具有不同的表面与体积比,并且用于捕获生物标记物的总内表面也不同。显示较高S/V的微流控装置可以捕获更多的microrna。这方面尤其重要,因为生物标记物,特别是microrna,在体液中只存在少量,因此,一种智能的浓缩和检测方法是受欢迎的。这里展示的微设备满足了这一要求,能够从生物液(如人血浆)中纯化被认为是癌症生物标记物的不同microrna。这些微设备的性能接近甚至超过了之前文献中报道的基于pdms的类似微设备的性能。这一考虑促进了真正使用基于pdms的微设备作为诊断工具的想法,以识别临床环境中含量低的microRNA生物标记物。


液体活检确实是生物标志物的宝贵来源,易于获取,因此对大规模筛查和在特定治疗期间对患者进行生物标志物分析非常有用。微流体装置可以简化液体活检,使这些方法不仅可以用于诊断,还可以用于跟踪疾病的进展。此外,检测低数量的生物标记物可以采取更早的病理诊断,可能有更好的结果。


论文链接:https://www.mdpi.com/2076-3417/10/11/3867/htm



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