德学者开发了一种光学显微镜的新方法,可分辨纳米级的荧光分子

   小金工        

2021年3月24日,德国哥廷根,由马克斯·普朗克生物物理化学研究所(MPI)的Stefan Hell和总部位于海德堡的医学研究的MPI领导的研究人员开发了一种光学显微镜方法MINSTED,该方法能够解析荧光标记的分子清晰度的细节。该技术源自同样由Hell开发的STED显微镜,他因此获得了2014年诺贝尔化学奖。该方法能够实现20到30 nm的分辨率,比当时可用的光学显微镜高约10倍。


Hell说:“ 20年前,我们从根本上打破了荧光的衍射分辨率极限STED显微镜;在那之前,这被认为是不可能的。那时,我们梦想着:利用STED,我们希望变得如此出色,以至于有一天我们将能够分离相距仅几纳米的分子。现在我们已经成功了。”


德学者开发了一种光学显微镜的新方法,可分辨纳米级的荧光分子

图1:MINSTED本地化原则。a,STED装置,分别具有用于激发和635 nm和775 nm的STED的共对准脉冲激光,以及用于螺旋相位调制的涡流相位板(VP),将STED光束转换成环形。插入物勾画出透镜焦平面中的激发和STED概率,以及荧光(E-PSF)的激发和STED概率。633 nm CW激光器用于焦平面中的荧光团预识别,而X - Y振镜单元还保持共焦雪崩光电二极管(APD)检测器与由扫描仪进行的圆形扫描的中心C i的光学共轭。光电侧向偏转器(X – Y EOD)。b,位于未知位置r FL处的活性荧光团(灰色恒星中的红色)通过环形X – Y扫描定位。对于每一个光子检测我,中心Ç我是由一小部分移α半径ř我朝向环形最小š我。同时,E-PSF的R i和FWHM d i被定标为γ  <1。中心C i因此,会聚到下部面板中指示的荧光团位置(灰色线),该荧光团还勾画了甜甜圈的相关部分,以便在归位过程中进行某些检测。一旦达到最小半径R min(黄色),在荧光团变为非活性(N次检测)后,仅更新C i并终止定位。柱状图说明了随着甜甜圈强度I i的增加,R i和d i的减小。c,归一化的激发概率(绿色)和荧光检测(E-PSF,黄色)与径向距离ρ的关系从焦点出发,以及STED光束甜甜圈(红色)的非归一化强度分布。虽然我我在本地化过程中不断增加的锐化E-PSF,强度经历由荧光团遗体关于我š的±内σ Ç的中心位置的位置范围Ç我以灰色突出显示。


MINSTED还基于Hell和他的团队在2016年获得的开发成果MINFLUX,该开发成果将STED原理中的元素与另一种光学显微镜技术PALM / STORM中的一种相结合。此方法实现的分辨率仅为几纳米。


然后,Hell提出理论,认为MINFLUX不会仍然是唯一的分子拆分方法,而是代表具有该分辨率水平的新技术家族的第一位成员。MINSTED证明了这种假设是正确的。该方法比MINFLUX更依赖原始STED原理。


地狱实验室的学生迈克尔·韦伯(Michael Weber)以及该方法的开发者说:“这具有优势。像MINFLUX一样,它可以达到分子分辨率,但是背景噪声较低。此外,现在可以几乎连续地将分辨率从200 nm调整到分子大小-1 nm。”


新方法使STED发挥了全部潜力。STED显微镜通过依次打开和关闭相邻的荧光特征或分子来工作,它使用激光束刺激分子,然后再激发第二束。所谓的STED光束可防止分子发荧光。但是,STED光束是中空的-光束的横截面将显示带孔的球形。仅在该甜甜圈形光束中间的分子可以发出荧光。因此,人们总是知道发射分子的位置。


德学者开发了一种光学显微镜的新方法,可分辨纳米级的荧光分子

图2:使用N  = 100个检测到的光子进行MINSTED定位的仿真。a,以SBR为参数的STED显微镜高斯E-PSF的扫描半径R与FWHM d的比率不同时的定位精度σ。虽然假想无限SBR的情况下的呼叫为[R最大化(黑线),背景的存在强制0.5 d  ≤  [R  ≤  d。对于大R,检测单个光子所提供的信息被背景遮盖,而对于小R,它被与E-PSF最大值d相连的许多其他光子检测遮盖。在本地化过程中,R的值和d被更新的每一个光子计数我到的特定值[R我和ð我分别。b,直到扫描中心位置C i的分布收敛到最终分布(静态d)之前所需的检测N c;中心位置C i距离荧光团距离d远大于d的模拟百分比,因此分类为丢失。c,定位精度σ与检测总数N和d的关系min作为参数。


在实践中,STED无法获得分子分辨率,因为环形的荧光抑制光束无法制造得足够坚固,以至于只有单个分子能够插入孔中。


为了解决该问题,首先通过独立的光化学转换过程(而不是通过甜甜圈光束本身)随机打开MINSTED中的荧光分子,将其隔离。防荧光的STED甜甜圈光束单独定位荧光分子,并以孔作为参考点


地狱部门的博士后研究员Marcel Leutenegger说:“如果孔与该分子重合,则该分子发光最强,您可以精确地知道它在哪里,因为始终知道STED甜甜圈束的确切位置,这就是为什么我们逐渐以1-3纳米(即分子的大小)的精度接近分子的原因。与光化学的开关有关,分辨率变成了分子规模。”


这项研究发表在《自然光子学》(Nature Photonics)上。



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